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通用基因编辑新策略：在内含子1定点插入CFTR 2-27修复囊性纤维化

Genelibs文献解读 2026-10-31 01:35 0 次阅读

原文：Targeted insertion of partial CFTR cDNA replicates native CFTR expression with restored channel function in CF airway epithelium.
期刊：Molecular therapy. Nucleic acids（影响因子 6.5） | PubMed | PMC 全文（含 PDF）

关键图表

囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）是一种由CFTR基因突变引起的常染色体隐性遗传病。过去十年里，以elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor（ETI，Trikafta）为代表的小分子“调节剂”药物极大改善了多数CF患者（PwCF）的临床结局。然而，这类药物发挥作用的前提是：突变型CFTR仍能产生一定量蛋白，调节剂才能帮助其正确折叠、转运至细胞膜，或增强其通道功能。

问题在于，CFTR的突变谱极其复杂：已有超过1000种致病突变分布在整个基因上，其中不少变异会引入提前终止密码子（PTC）或造成严重剪接缺陷，导致根本无法产生CFTR蛋白。对于携带两个这类“无效突变”的患者来说，现有调节剂疗法基本无效。因此，科学界正在积极开发不依赖突变类型的通用型基因疗法，例如递送完整野生型CFTR的mRNA或cDNA，或者采用碱基编辑、先导编辑等突变特异性策略。

近期，一项发表于Molecular Therapy. Nucleic Acids（影响因子6.5）的研究提出了一种几乎“无视突变类型”的通用基因编辑治疗方案：将部分CFTR cDNA（外显子2–27，记作CFTR 2-27）定点插入到CFTR基因自身的内含子1（intron 1）中，即所谓TI-1策略。该研究在患者原代气道基底干细胞中实现了高效整合，并在完全分化的气道上皮中恢复了CFTR通道功能，同时保持了天然CFTR的表达模式。

研究背景：为什么要做“通用型”CFTR修复

CFTR基因编码一种阴离子通道蛋白。在气道上皮中，CFTR功能缺失会导致黏液脱水、黏稠，进而引发慢性感染和炎症。由于CF是隐性病，只要纠正一个突变等位基因，就能恢复到“携带者状态”并重建部分功能。

作者团队此前已开发过一种通用校正思路：把 corrective transgene（校正性转基因）插入到内源突变CFTR位点中，利用天然启动子、调控元件和染色质结构，使校正后的CFTR mRNA以生理水平、细胞类型特异性地表达。他们早先的工作把CFTR外显子9–27（CFTR 9-27）插入到内含子8（TI-8），在原代CF患者气道基底干细胞中实现了50%–62%的等位基因靶向，并在气液界面（ALI）培养中恢复了约34%–56%的非CF水平CFTR通道功能。

但TI-8只适用于至少一个致病突变位于内含子8下游的患者。为了让“几乎所有”PwCF都能受益，团队把目标进一步上游化：把CFTR 2-27插入内含子1（TI-1）。这样一来，原则上可以纠正插入位点下游的任何CFTR变异。不过，内含子1长达约24 kb，且含有调控序列（如DNase超敏感位点、CTCF结合位点），因此必须确认：在哪里插入才不会破坏天然调控，又能让转基因正确表达。

核心发现：从筛选位点到功能恢复

研究首先在内含子1中筛选候选插入位点。他们避开了重复序列、常见SNP，以及已知调控元件（如185+10 kb位点、CTCF占据位点），最终选出三个符合标准的位点（R1、R3、F1），并构建报告系统评估整合效率和表达水平。报告载体包含组成型表达盒PGK-mScarlet-SV40用于流式检测整合效率，以及CFTR外显子2–4连接NanoLuc荧光素酶（NLuc）的元件，前面带剪接受体（SA）、后面带多聚腺苷酸化信号（polyA），从而与内源CFTR外显子1剪接形成融合蛋白。

通过电转Cas9/gRNA RNP并用AAV-6递送供体，他们在F508del/F508del原代气道基底细胞中测试了四个位点（含直接连外显子1的对照ex1）。结果显示，所有位点都能表达荧光素酶；其中R1和R3的表达不低于甚至高于对照，且BGH polyA信号优于SV40和rBG。最终，R1位点配合BGH polyA被选用于后续CFTR 2-27的整合。

然而，CFTR 2-27加上同源臂约5 kb，超过了AAV-6的有效包装能力；团队尝试AAV-6递送后，插入效率低于1%。于是他们转向整合酶缺陷型慢病毒载体（IDLV）。IDLV可包装约8–9 kb供体DNA，且相比AAV在造血干/祖细胞中显示出更低细胞和基因组毒性。

在电转靶向R1位点的RNP后，立即用IDLV递送报告基因。9天后，仅给供体时mScarlet+细胞不到0.5%，而RNP加供体达到27.3%。进一步加入DNA-PK抑制剂AZD7648（抑制非同源末端连接NHEJ、促进HDR）后，mScarlet+细胞升至51.5%。在三位不同CF供体来源的基底细胞中，AZD均使TI效率约翻倍；虽然高剂量IDLV会短暂降低细胞数，但100 TU/cell时TI频率更高，因此被选用。

接下来，团队用IDLV递送真正的校正性CFTR 2-27转基因（带SA、BGH polyA及R1位点同源臂）。分子鉴定显示：外侧PCR、5′和3′内侧-外侧PCR均证实全长插入；半定量EcoRI酶切分析表明，在三位供体基底细胞中，每个等位基因的TI频率高达约66%–77%。深度测序进一步校正后确认了高比例的TI-1等位基因；SMRT-seq也在F508del/F508del细胞中检测到对应4720 bp插入的TI-1等位基因。

**Figure 1** 使用IDLV在原代基底细胞中评估靶向插入 (A) 靶向操作示意图，包括分子和功能评估的时间线。(B) CFTR示意图，聚焦插入位点处的内含子1（上）和报告基因插入后（下）。(C) 在存在或不存在AZD7648时，以mScarlet+细胞百分比（左）和细胞回收率（右）衡量的插入效率比较。(D和E) 在存在AZD7648且IDLV剂量递增时，来自三个不同细胞供体的以mScarlet+细胞百分比（D）和细胞回收率（E）衡量的插入效率。三次独立实验的平均值±标准差。

**Figure 2** 使用野生型CFTR2-27转基因评估TI-1 (A) CFTR示意图，聚焦插入位点处的内含子1（上）和CFTR2-27插入后的DNA结构（下）。gRNA切割位点周围和插入的CFTR2-27周围的水平箭头代表用于插入分子检测的引物。数字对应表S2中的引物列表。(B) 来自三个细胞供体的代表性琼脂糖凝胶，使用(A)中所示的引物对。从上到下：out-out PCR（引物5和6）、5′ in-out PCR（引物1和2）、3′ in-out PCR（引物3和4）和EcoRI检测PCR（引物7和4）。EcoRI检测PCR产物经EcoRI酶切，产生TI-1等位基因特异的切割条带。RNP/IDLV处理样本下方显示了被切割的PCR产物百分比。红色箭头表示与成功插入一致的条带，仅在RNP/IDLV处理的样本中观察到；黑色箭头表示来自未修饰或小indel等位基因的条带。(C) 基于扩增子拷贝数（图S4C）校正后，深度测序分析（图S4B）的汇总结果。图上方数字代表基于序列被鉴定为TI-1的等位基因比例。三次独立实验的平均值±标准差。(D) 来自F508del/F508del细胞中代表性实验的SMRT-seq分析汇总。图中显示插入和缺失大小的分布：从50 bp缺失到49 bp插入的事件被分类为未修饰或indels；大于50 bp的缺失被分类为大片段缺失；大于或等于50 bp的插入被分类为大片段插入。缺失长度以负值表示；因此，值< −50对应大于50 bp的缺失。左图显示仅RNP处理的细胞，右图显示RNP/IDLV处理的细胞。在RNP/IDLV处理的细胞中，4,720 bp的插入对应TI-1等位基因。50至4,499 bp之间的大片段插入反映部分IDLV插入，而≥5,500 bp的插入与一侧连接处为HDR、另一侧连接处为NHEJ的IDLV捕获一致。

更重要的是功能结果。将TI-1处理过的基底细胞（未经校正细胞富集）在ALI条件下分化为完全分化的气道上皮后，Western blot检测到成熟、糖基化CFTR蛋白恢复；Ussing chamber实验显示CFTR通道活性显著恢复，黏液水合和转运明显改善。也就是说，即便不对校正细胞进行分选，整体上皮也已获得有治疗意义的功能恢复。

**Figure 3** TI-1在TI-1处理的原代细胞中导致CFTR功能的显著恢复 (A) 来自图2C所示G542X/R785X三个独立编辑实验的ALI培养物的CFTR和βActin（内参）的蛋白质印迹。(B) ALI培养4周后进行的Ussing chamber测定的代表性轨迹。每条轨迹代表TI-1或48 h预处理（DMSO溶剂对照或ETI）的一种实验条件。垂直箭头表示记录期间进行的急性处理。(C) 来自三个不同细胞供体的(B)分析汇总，与非CF比较。图上方数字表示CFTR抑制剂-172处理后测得的非CF电流的百分比。三次独立实验的平均值±标准差。(D) 4周ALI培养物的PCL（上）和MCT（下）的μOCT测量汇总。显示了以中位数为中心的4个技术重复（每个1–2张图像）的单独测量值。∗p < 0.05；∗∗p < 0.01；∗∗∗∗p < 0.0001。

同时，免疫染色表明TI-1处理并不改变基底干细胞的分化能力：ALI培养4周后，基底细胞（P63、NGFR、KRT5）、分泌细胞（SCGB1A1等）、纤毛细胞等标志物均正常出现。

**Figure 4** TI-1不改变TI-1处理的原代基底干细胞的分化能力 (A) 4周ALI培养物的免疫染色，用基底细胞（P63、NGFR、KRT5）、分泌细胞（SCGB1A1/CC10、MUC5B、MUC5AC）和纤毛细胞（ACT）的标志物染色。比例尺，100 μm。(B) 两个细胞供体在ALI培养4周后，比较未处理与TI-1(t)细胞的细胞类型簇的UMAP图。(C) (B)中未处理或TI-1(t)细胞每种细胞类型的定量。

方法亮点：保持天然染色质架构与细胞类型特异性表达

该研究的一个关键创新是“借巢生蛋”：不把CFTR cDNA放到随机位点或强启动子下，而是插回内源CFTR基因座的内含子1，利用天然启动子和调控环境。为了验证这样做是否真的模拟了天然表达，团队进行了ATAC-seq和单细胞RNA测序（scRNA-seq）。

ATAC-seq聚焦CFTR位点及其调控元件显示，插入CFTR 2-27后，开放染色质峰型与对照相比没有明显改变，说明天然CFTR染色质架构未被破坏。

**Figure 5** TI-1不改变CFTR基因座的ATAC-seq特征聚焦CFTR及其调控元件的ATAC-seq。每个峰代表一个开放染色质区域。下方为插入位点的放大视图。

scRNA-seq进一步在分化后的ALI培养物中分析细胞集群。UMAP图鉴定出各类细胞群，并比较校正转基因来源的CFTR mRNA与内源突变CFTR的表达分布。

**Figure 6** TI-1不改变分化ALI培养物中CFTR的转录调控 (A) 左：显示所有样本中细胞簇鉴定的UMAP。中和右：显示每个细胞簇中总CFTR（突变加校正）分布的UMAP，并比较两个细胞供体的未处理与TI-1(t)细胞。(B) 小提琴图，显示A中每个簇的对数归一化总CFTR表达水平，并比较未处理与TI-1(t)细胞。(C) (A)中各簇间总CFTR表达的分布。

结果非常关键：来自校正性野生型CFTR 2-27转基因的CFTR mRNA，在细胞类型分布和表达水平上与天然突变CFTR相当——即在离子细胞中最高、在部分分泌细胞中中等、在基底和纤毛细胞中低至可忽略。这意味着，TI-1不仅恢复了蛋白功能，还复制了天然CFTR的细胞类型特异性表达模式，避免了异位过表达可能带来的风险。

**Figure 7** 来自校正型野生型CFTR2-27转基因的CFTR mRNA以与天然突变CFTR相当的细胞类型分布和表达水平表达 (A) 区分突变与校正转录本的感兴趣区域的比对读段数量和百分比。(B) 未处理（上）或TI-1(t)细胞（中和下）的小提琴图，按图6A中鉴定的簇显示对数归一化的CFTR表达水平。突变CFTR图包括与天然CFTR 3′ UTR比对的读段。校正CFTR图包括来自外显子26–27（不包括3′ UTR）的读段（图S7B）加上BGH polyA。

应用意义：迈向“几乎突变无关”的CF治愈策略

这项研究的意义在于，它展示了一种几乎完全“mutation-agnostic（不挑突变）”的治疗路径。只要患者的CFTR突变位于内含子1下游（实际上涵盖了绝大多数乃至几乎所有致病变异），就可以通过TI-1插入CFTR 2-27来恢复功能。由于CF是隐性病，纠正一个等位基因即可重建携带者水平的CFTR功能。

与递送整个CFTR cDNA或mRNA相比，定点整合利用内源调控，可能更安全、更生理；与碱基编辑/先导编辑等突变特异性方法相比，TI-1不需要为每种突变单独设计工具，具有“通用药”的潜力。此外，靶向气道基底干细胞这一 resident stem cell 群体，意味着校正后的细胞可自我更新并分化为分泌细胞、纤毛细胞和离子细胞，从而可能实现长期疗效。

当然，该策略目前仍处于临床前阶段：研究在原代细胞和ALI培养、以及既往的异种移植模型中验证，未来还需解决体内递送、安全性、长期稳定性等问题。但作者也指出，这些结果不仅适用于当前的Cas9/gRNA加IDLV方案，也可能推广到其他编辑和递送方法中的CFTR 2-27整合。

总体而言，这项工作把CF基因治疗从“针对部分突变”推进到“面向几乎所有突变”的新阶段，为那些目前无法从调节剂药物中获益的CF患者带来了新的希望。

本文图片转载自 PMC 开放获取全文，仅供学习参考，请以原文为准。

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