原文：Machine learning-driven discovery of aniline phenylacetate derivatives as LasR-targeted biofilm inhibitors against Pseudomonas aeruginosa infections.
期刊：Acta pharmaceutica Sinica. B（影响因子 14.6） |
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关键图表
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Scheme 1 Scheme 1: 试剂与条件：(i) DCC、DMAP、DCM，4 °C，20 min；然后25 °C，6 h；(ii) Pd(PPh3)4、K2CO3、THF/H2O（4:1，v/v），80 °C，18 h；(iii) XPhos Pd G2、K2CO3、1,4-二氧六环/H2O（1:1，v/v），80 °C，18 h。
Scheme 2 Scheme 2: 试剂与条件：(i) 草酰氯、DCM、DMF，25 °C，6 h；(ii) 吡啶、DCM，25 °C，4 h；(iii) NH2OH·HCl、Fe、MeOH、H2O，8 h。
Figure 3 化合物2g的抗生物被膜活性及结构基础。(A) 构效关系（SAR）分析，突出关键修饰：有益特征（红框）包括3位吸电子基团、酰胺连接子（2原子链）、含氮基团；不利因素（带叉圆圈）包括大体积取代基和氟取代。(B) 生物被膜生物量（μm3/μm2）定量，显示2g（0.1–20 μmol/L）的剂量依赖性减少。(C) 通过COMSTAT进行的平均厚度分析，显示在亚MIC浓度下显著变薄。(D、E) 多重耐药菌株MDR-PA FB（D）和MDR-PA 1167（E）中的生物被膜抑制率（%），证明广谱效力。(F) 处理24 h后的三维CLSM重建（SYTO9/PI染色）：结构完整（对照）、部分破坏（0.1–1 μmol/L）、基质崩解（10 μmol/L）、近乎完全清除（20 μmol/L）。比例尺 = 100 μm。(G) 2g抑制生物被膜的动力学分析。(H) 生物被膜内活菌的定量分析，表示为log10 CFU/cm2。(I) 从经所示浓度2g处理的生物被膜中回收的细菌菌落代表性图像。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是临床最棘手的机会性致病菌之一。它不仅能引起囊性纤维化患者慢性肺部感染、尿路感染、皮肤伤口感染乃至医院内获得性感染，更因其强大的生物膜（biofilm）形成能力而对多种抗生素天然耐受。生物膜是细菌包裹在自身分泌保护性基质中的“集体社区”，通过物理屏障和基因表达改变，让常规抗生素难以渗透、免疫细胞难以清除，从而导致感染迁延不愈、死亡率升高。
在这一过程中，细菌的“群体感应”（quorum sensing, QS）系统扮演了总指挥角色。其中，LasR是铜绿假单胞菌QS层级中的核心调控蛋白：它作为转录调节因子，激活生物膜成熟、绿脓菌素（pyocyanin）、弹性蛋白酶等关键毒力因子表达。因此，抑制LasR就等于从源头削弱细菌的“集体作战能力”，而不是直接杀死细菌——这有望避免传统杀菌药带来的强选择压力与耐药进化。
然而，过去报道的LasR抑制剂普遍面临瓶颈：天然产物如黄芩素水溶性差、体内代谢快；咪唑类化合物仅有计算预测而缺乏直接生物物理验证；多肽类抑制剂分子量大、透膜差、易被降解。更关键的是，LasR配体结合域在没有自身诱导物时本身不稳定，多数已有抑制剂只报告了功能性的IC50，却没有直接的结合亲和力（KD）数据，靶点结合始终未被严格证实。
核心发现：机器学习筛出先导化合物2g
针对上述难题，研究团队建立了一套“图神经网络—药效团—分子对接—分子动力学”多维机器学习虚拟筛选平台，从47,256个化合物中高效锁定候选分子，并最终通过理性设计、合成与生物评价，发现苯胺苯乙酸衍生物化合物2g是高效LasR抑制剂。
研究首先基于1,029个已报道LasR抑制剂构建数据集，用Chemprop包开发图神经网络（GNN）二分类模型。模型表现稳健：训练集准确率99%，测试集准确率83%，AUC–ROC达0.92，F1分数0.80，MCC为0.65，优于KNN、SVM等方法。当GNN打分超过0.75时，对活性抑制剂（IC50 < 100 μmol/L）的预测准确率超过99%。
Figure 1 基于机器学习的LasR抑制剂多维筛选。
随后，GNN从47,256个SMILES结构库中过滤出4,207个打分>0.75的分子；药效团模型要求完全匹配两个氢键受体、一个氢键供体、一个疏水中心且Phase Screen Score > 0.974，缩小到914个；再经Glide SP（≤ −6.823）和XP（≤ −7.035）分子对接，得到171个候选，均能与关键残基Tyr56、Asp73或Ser129相互作用。分子动力学模拟（100 ns）显示1f、1h与LasR复合物RMSD分别仅为1.341 Å和1.368 Å，在约50 ns达到平衡；MM/GBSA计算结合自由能分别为−50.367和−71.673 kcal/mol，提示强结合。
Figure 2 基于图神经网络-药效团-对接-分子动力学的机器学习模型的虚拟筛选。(A) 基于机器学习模型的虚拟筛选流程。(B) 化合物1f（左）和1h（右）的药效团模型。(C) 分子对接（SP、XP）筛选图，Glide SP对接得分 < −6.823（HSL评分阈值）且Glide XP对接得分 < −7.035（HSL评分阈值）。(D) 命中化合物1f（左）、1h（右）与LasR蛋白分子间相互作用的3D表示。(E) LasR蛋白、命中化合物1f（左）、1h（右）及其复合物的RMSD，约50 ns时达到平衡。
在合成方面，团队通过酰胺缩合（DCC/DMAP）、Suzuki–Miyaura偶联、还原氨化等短路线制备了1a–1j、2a–5f等多个系列衍生物，并用1H NMR、13C NMR和高分辨质谱确认结构。以结晶紫法评估对PAO1生物膜抑制活性：所有化合物均无直接杀菌作用（MIC > 256 μmol/L），说明它们只干扰QS而不杀死细菌。
初筛中，氟代衍生物1f表现突出（IC50 = 0.27 ± 0.05 μmol/L），优于氯代（1e, 4.45 μmol/L）和三氟甲基（1d, 1.72 μmol/L）类似物，显示卤素取代对活性关键。进一步结构优化得到2g——同时带有–NO2和–CF3基团的苯胺苯乙酸酰胺，其抗生物膜IC50低至0.14 ± 0.08 μmol/L，比阳性对照阿奇霉素（Azm, IC50 = 12.45 ± 3.12 μmol/L）强约88倍。表面等离子共振/生物物理实验证实2g与LasR直接结合，解离常数KD = 38.97 μmol/L。
Scheme 3 Scheme 3: 试剂与条件：(i) EDCI、HOBt、Et3N、DCM，4 °C，20 min；然后25 °C，6 h。
机制上，转录组学显示2g选择性抑制LasR调控的毒力通路：降低绿脓菌素产生、削弱细菌运动性，并同时作用于全局转录调节因子Vfr，形成“LasR+Vfr”双重干扰。在广谱QS干扰实验中，2g还能抑制报告菌株Chromobacterium violaceum CV026的紫色杆菌素生成，说明其干扰QS信号的能力不限于单一菌种背景。
Figure 4 2g介导的生物被膜抑制的转录调控及机制基础。(A–D) 浮游态和生物被膜相关铜绿假单胞菌的比较转录组分析。(A) 浮游细胞中差异表达基因（DEGs）的火山图（1 μmol/L 2g vs. 对照）。(B) 生物被膜相关细胞中DEGs的火山图（20 μmol/L 2g vs. 对照）。红点和绿点分别表示显著上调和显著下调的基因（|FC| > 1.3，P < 0.05）。关键调控因子（lasR、vfr）已突出显示。(C) 浮游细胞中层次聚类DEGs的热图。(D) 显示生物被膜相关细胞中运动性、QS和EPS相关基因下调的热图。(F–H) 确认与LasR直接且竞争性结合的SPR分析。(F) 在不存在或存在10 μmol/L AHL时，2g（0.39–100 μmol/L）与固定化LasR结合的SPR传感图叠加，表明竞争性抑制。(G) 由传感图得出的竞争性结合等温线。(H) 显示浓度依赖性结合的SPR传感图（KD = 38.97 ± 9.10 μmol/L）。(I) 200 ns分子动力学模拟期间2g‒LasR复合物的RMSD稳定性。(E) 生物被膜相关基因的qRT-PCR验证（∗∗∗P ≤ 0.001，∗∗∗∗P ≤ 0.0001；平均值 ± SD，n = 3）。(J) 与LasR（白色）结合的2g（紫色）的结构叠加，关键残基（Tyr56、Asp73、Trp88）已突出显示。
Figure 5 化合物2g的广谱QS干扰及选择性毒力抑制。(A) 化合物2g对生物传感器菌株C. violaceum CV026中紫色杆菌素产生的定量抑制。(B‒D) 化合物2g对铜绿假单胞菌毒力的剂量依赖性效应。(B) 绿脓菌素活性。(C) 鼠李糖脂产生。(D) 胞外多糖（EPS）合成。(E–H) QS报告系统荧光强度：(E) PAO1-gfp，(F) PAO1-lasB-gfp，(G) PAO1-rhlA-gfp，(H) PAO1-pqsA-gfp。(I) 代表性扫描电子显微镜（SEM）图像，显示2g诱导的菌毛减少（红色箭头）和结构改变（比例尺：4 μm）。(J) 2g处理（0–20 μmol/L）下的集群/泳动运动表型。所有实验均包含未处理对照。数据表示为平均值 ± SD（n = 3）。
方法亮点：从AI筛选到体内外验证的全链条
本研究的真正创新在于把机器学习与经典计算药物设计无缝衔接：GNN先做“粗筛”，药效团做“特征匹配”，分子对接做“空间打分”，分子动力学做“稳定性验证”，最后用化学合成与生物学实验闭环确认。相比传统虚拟筛选，这一流程大幅降低了假阳性，并首次为苯胺苯乙酸类LasR抑制剂提供了直接KD结合数据。
在药效之外，2g还展现出转化医学优势：小鼠皮肤伤口感染模型中，2g与环丙沙星（Cip）或妥布霉素（Tob）联用，使两种抗生素的有效剂量分别降低1000倍和500倍，并显著抑制耐药演化。组织学分析显示，联合治疗加速伤口愈合、促进组织重塑并调节细胞因子反应。
Figure 6 化合物2g在体外增强抗生素对铜绿假单胞菌的效力并抑制耐药性发展。(A–E) 体外协同活性：(A) 2g（0–10 μmol/L）+ Cip（0–10 μg/mL）对铜绿假单胞菌PAO1的生长抑制。(B) 2g（0–10 μmol/L）+ Tob（0–10 μg/mL）对PAO1的生长抑制。(C) 2g（0–10 μmol/L）+ 阿奇霉素（Azm，0–32 μg/mL）对PAO1的生长抑制。(D) 2g（0–10 μmol/L）+ Cip（0–10 μg/mL）对铜绿假单胞菌FB的生物被膜抑制。(E) 2g + Tob（0–10 μg/mL）对铜绿假单胞菌PA1167的生长抑制。(F–I) 连续传代期间的耐药抑制：(F) 单药治疗与2g联合治疗下PAO1中Cip耐药性的演变。(G) 铜绿假单胞菌FB菌株中Cip耐药性的发展。(H) 持续暴露期间PAO1中Tob耐药性的演变。(I) PA1167中Tob MIC的进行性升高。(J、L) 在lasR敲除突变体（PAO1-△lasR）中与Cip（J）和Tob（L）的评估。(K、M) 在回补菌株（PAO1-△lasR::lasR）中与Cip（K）和Tob（M）的评估。(N) 铜绿假单胞菌PAO1的时间-杀菌动力学。细菌悬液（106 CFU/mL）用化合物2g（20 μmol/L）、抗生素（Cip，0.125 μg/mL；Tob，0.125 μg/mL）或其组合处理24 h。
Figure 7 化合物2g在小鼠伤口感染模型中增强抗生素对铜绿假单胞菌的治疗效力。使用BALB/c小鼠局部感染模型评估体内效力和安全性。局部给药；剂量以mg/kg体重表示（基于30 μL给药体积计算），局部浓度见括号。化合物2g以0.01 mg/kg（20 μmol/L）应用。(A–C、G–J) Cip联合评估：(A) 显示伤口匀浆中细菌菌落的十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板代表性图像。(B) 9天内伤口愈合进展的代表性照片。(C) 主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色，显示无全身毒性迹象。(G) 细菌负荷定量（Log10 CFU/伤口）。(H) 伤口闭合率定量（伤口面积减少，%）。(I) 治疗期间体重变化。(J) 用生理盐水（对照）、Cip单药治疗和Cip联合治疗的小鼠主要器官湿重变化。(D–F、K–N) Tob联合评估：(D) 琼脂平板上细菌菌落代表性图像。(E) 伤口愈合进展照片。(F) 主要器官的组织学分析。(K) 细菌负荷定量（Log10 CFU/伤口）。(L) 伤口面积减少分析。(M) 体重监测。(N) 用生理盐水（对照）、Tob单药治疗和Tob联合治疗的小鼠主要器官湿重变化。所有定量数据均表示为平均值 ± SD（所有其他实验n = 6）。比例尺 = 100 μm（C、F）。
Figure 8 联合治疗通过组织重塑和细胞因子调节加速伤口愈合。(A) 感染小鼠伤口的分层H&E分析：各治疗组的伤口形态（800 μm比例尺）、瘢痕面积和真皮再生（100 μm比例尺）：生理盐水（对照）、Cip（1、0.01、0.001 mg/mL）和Cip + 2g（0.01/0.001 mg/mL Cip + 20 μmol/L 2g）。(B‒E) 治疗后小鼠皮肤伤口中VEGF、TGF-β1、TNF-α和IL-6的表达。(F) 空间细胞因子分布（IHC，100 μm比例尺）：联合治疗中VEGF向血管极化、TGF-β1真皮沉积减少、TNF-α/IL-6白细胞信号集中，而对照组中呈弥漫性表达。
安全性方面，2g在0–100 μmol/L范围内对HepG2、A549等细胞无细胞毒性，也无溶血现象；药代动力学显示口服生物利用度达26.8%，具备成为口服或局部用药的潜力。
Figure 9 化合物2g的综合安全性和药代动力学特征。化合物2g的安全性评估和药代动力学特征。(A–C) 2g（0–100 μmol/L）暴露48 h后对HepG2（A）、A549（B）和293 T（C）细胞的细胞毒性（CCK-8测定）。(D) 从24至120 hpf用2g（12.5–100 μmol/L）处理的斑马鱼幼虫存活率。(E–H) 对小鼠（E、F）和兔（G、H）红细胞的溶血活性。显示了代表性图像（E、G）和定量率（F、H）。Triton X-100（0.4%）和PBS分别作为阳性和阴性对照。(I–M) SD大鼠中的药代动力学和组织学分析。(I) 腹腔注射（i.p.，2.0 mg/kg）和口服（p.o.，10.0 mg/kg）给药后的血浆浓度-时间曲线。(J、K) i.p.（J）和p.o.（K）给药后主要器官中的组织分布特征。(L、M) i.p.（L）和p.o.（M）给药后主要器官的代表性H&E染色切片。比例尺：100 μm。数据表示为平均值 ± SD（体外n = 3；体内n = 6）。
应用意义：抗耐药感染的新范式
这项发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》（影响因子14.6）的工作说明：针对QS主控因子LasR的“非杀菌型”抑制剂，可以既瓦解生物膜、削弱毒力，又大幅恢复现有抗生素的疗效。2g不直接杀菌，因此选择压力小、不易诱发耐药；与环丙沙星、妥布霉素的千倍级协同，意味着临床或可用更低剂量抗生素达到治疗效果，减少毒副作用。
对科研而言，该研究提供了一套可复用的“AI+计算+实验”抗生物膜药物发现模板；对临床而言，2g代表了一类可转化策略——用机器学习优化的小分子去“解除细菌武装”，而非正面强攻，为多重耐药铜绿假单胞菌感染、慢性伤口与囊性纤维化肺部感染带来新希望。
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