原文：Maternal microbiota shapes brain and neuroendocrine development in piglets.
期刊：iMeta（影响因子 44.4） |
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在哺乳动物早期生命发育过程中，母体不仅是营养与免疫因子的来源，其携带的微生物群落也被认为深度参与后代生理程序的“编程”。然而，母体菌群究竟如何在细胞与转录层面重塑发育中的大脑和神经内分泌系统，尤其在大型哺乳动物中，一直缺乏高分辨率的证据。近日，一项发表于 iMeta（影响因子 44.4）的研究以家猪为模型，结合无菌（germ-free, GF）仔猪与母体菌群移植（maternal microbiota transplantation, MMT）模型，构建了跨越脑、肠与神经内分泌轴的多器官单细胞图谱，系统揭示了母体微生物信号对新生仔猪脑发育和应激轴编程的影响。
研究背景：为什么要用猪，而不是小鼠？
大脑是哺乳动物最复杂的器官之一，具有高度的细胞异质性和精细的功能分区。过去几十年，啮齿类模型为神经发育研究提供了大量洞见，但小鼠与人在脑结构上的差距限制了转化价值。相比之下，家猪（Sus scrofa domesticus）的大脑与人脑更为相似：具有沟回状皮层（gyrencephalic cortex）、广泛的基底-丘脑-皮层环路以及Willis环；成熟猪与人的脑白质含量均超过60%，而成熟大鼠不足12%。此外，在关键脑区（如小脑、下丘脑）的整体表达谱上，猪与人的保守性甚至高于人与小鼠。
与此同时，“肠-脑轴”已成为连接肠道稳态与脑发育、生理及疾病的核心双向网络。已有研究表明，肠道菌群可通过微生物代谢产物（如吲哚衍生物、短链脂肪酸）重塑多个脑区的细胞组成、转录程序和神经功能。母体菌群更被证明能调控后代干细胞功能、影响胎儿神经发育。而下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴作为神经内分泌系统的关键接口，可能是早期环境信号影响生理适应和发育轨迹的枢纽。但一个核心问题仍未回答：在大型哺乳动物中，母体菌群暴露能否塑造发育中大脑和神经内分泌系统的细胞与转录组织？
核心发现一：构建跨五个脑区与HPA轴的高分辨率图谱
研究团队使用出生当天（GFD0）、出生后第30天无菌（GFD30）以及第30天母体菌群移植（MMTD30）仔猪，每组3头，采集五个脑区——下丘脑（HYP）、脑干（BS）、杏仁核（AMY）、海马（HIP）和内侧前额叶皮层（mPFC），以及垂体（PIT）、肾上腺（ADR）和五段肠道组织。通过单核RNA测序（snRNA-seq），他们在五个神经解剖区域中获得 504,489 个高质量细胞核（全文多器官合计 673,623 个高质量核），鉴定出六大主要细胞谱系：星形胶质细胞（AQP4、GFAP）、内皮细胞（FLT1、VWF）、小胶质细胞（CSF1R、CX3CR1）、神经元（RBFOX1、NRXN3）、少突胶质细胞（OPALIN、MOBP）和少突胶质前体细胞（OPCs，PCDH15、PDGFRA）。
借助 Stereo-seq 空间转录组技术，团队进一步在下丘脑切片上绘制了这些细胞群的空间分布图。结果显示，母体菌群暴露与发育中猪脑细胞组成和空间结构的协同重塑有关：例如，与GFD30相比，MMTD30中少突胶质细胞比例上升、星形胶质细胞减少，提示母体菌群在出生后早期选择性重塑了神经元-胶质细胞组成。
FIGURE 1 FIGURE 1: 跨发育阶段和微生物条件的猪脑多区域单核与空间转录组图谱。(A) 实验设计与分析流程。使用GFD0、GFD30和MMTD30仔猪（每组n = 3）进行多器官样本采集及下游分析，包括五个脑区（AMY、HIP、HYP、BS和mPFC）、PIT、ADR和五个肠段。(B) 504,489个高质量细胞核的整合UMAP可视化，按主要细胞类型着色。标注了每个细胞群的数量。(C) 星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、OPCs、神经元和内皮细胞的经典标志基因点图。点的大小表示表达每个基因的细胞核百分比，颜色表示标准化后的平均表达量。(D) 六大主要细胞谱系转录谱的层次聚类两两相关热图。(E) 五个脑区和三个实验组中六大主要细胞谱系的相对比例。(F) GFD30和MMTD30仔猪HYP切片中六大主要细胞群的复合空间图。(G) 相应HYP切片中单个主要细胞群的空间分布。上排和下排分别代表GFD30和MMTD30。ADR，肾上腺；AMY，杏仁核；BS，脑干；GFD0，出生后第0天的无菌仔猪；GFD30，出生后第30天的无菌仔猪；HIP，海马；HYP，下丘脑；MMTD30，出生后第30天的母体微生物群移植仔猪；mPFC，内侧前额叶皮层；OPCs，少突胶质前体细胞；PIT，垂体。
核心发现二：母体菌群重编程神经元成熟与通讯网络
在比较 MMTD30 与 GFD30 的差异表达基因时，神经元在多个脑区中拥有最多数量的差异表达基因（DEGs），说明神经元是母体菌群暴露的主要转录响应者。研究人员将神经元分为三大类：谷氨酸能神经元（SLC17A7、CAMK2A）、GABA能神经元（GAD1、GAD2）和未成熟神经元（DCX、SOX11）。伪时间轨迹分析显示，未成熟神经元位于发育轨迹早期，而谷氨酸能和GABA能神经元分布于后续状态；母体菌群移植与兴奋性神经元成熟相关的转录特征有关。
在杏仁核中，未成熟和谷氨酸能神经元的差异基因富集于突触信号、跨突触信号和化学突触传递；GABA能神经元则富集于突触信号、化学突触传递调节等过程。值得注意的是，基因 LMO1 呈现动态模式：从GFD0到GFD30表达下降，但在MMTD30中相较于GFD30又上升，提示母体菌群可能调节与出生后早期神经元成熟相关的转录轨迹。
除了“以神经元为中心”的视角，脑功能还依赖神经元-胶质细胞之间的复杂对话。CellChat分析显示，星形胶质细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、未成熟神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞之间存在广泛推断的通讯网络。两组间既有各自特异的配体-受体对，也有共享但通讯概率不同的通路（如NRG、PTN、SLIT、SLITRK、FGF、PSAP）。其中，NRG1–ERBB4 与 NRG3–ERBB4 轴在MMTD30中推断通讯概率更高，而该轴已知参与神经元成熟和突触发育。此外，血浆中谷氨酸和谷氨酰胺水平在MMTD30中呈升高趋势，说明母体菌群移植伴随循环谷氨酸-谷氨酰胺代谢谱改变。
FIGURE 2 FIGURE 2: 母体微生物群相关的神经元转录状态、发育轨迹、细胞间通讯及血浆谷氨酸–谷氨酰胺代谢重塑。(A) MMTD30与GFD30仔猪间跨细胞类型和五个脑区的DEGs排序数量。点的大小表示DEGs数量，颜色表示脑区。(B) 使用ClusterGVis鉴定的GFD0、GFD30和MMTD30中的三个基因表达模式（C1–C3）。热图显示标准化表达（Z分数），线图总结相应的组相关表达模式。(C) 分为三大类群的神经元细胞核UMAP可视化：谷氨酸能神经元、GABA能神经元和未成熟神经元。(D) 神经元群的拟时间轨迹。整合轨迹按拟时间着色，并显示GFD0、GFD30和MMTD30的分组分布。(E) MMTD30与GFD30间AMY中谷氨酸能、GABA能和未成熟神经元的差异基因表达谱。标注了代表性上调和下调基因，右侧显示选定的富集GO条目。(F) GFD30和MMTD30仔猪中星形胶质细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、未成熟神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞间CellChat推断的细胞间通讯网络。(G) 跨源–靶细胞组合的组特异性配体–受体对数量。蓝色和黄色柱分别表示仅在GFD30和MMTD30中检测到的相互作用。(H) GFD30与MMTD30间共享LR对的推断通讯概率比较。颜色表示信号通路，虚线对角线表示组间通讯概率相等。(I) GFD30和MMTD30中选定源–靶细胞组合的前10个LR对热图。颜色表示推断的通讯概率。(J) GFD30和MMTD30仔猪血浆谷氨酸和谷氨酰胺浓度。单个点代表独立生物学重复。数据以平均值 ± 标准差表示。DEGs，差异表达基因；GO，基因本体；GFD0，出生后第0天的无菌仔猪；GFD30，出生后第30天的无菌仔猪；LR，配体–受体；MMTD30，出生后第30天的母体微生物群移植仔猪。所有snRNA-seq和血浆分析均基于每组三头独立仔猪（n = 3）。
核心发现三：胶质细胞调控程序与HPA轴应激重塑
团队进一步提取了 332,425 个胶质细胞核（星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞），利用 SCENIC 分析识别出六个共调控模块，涉及跨突触信号、神经元发育、细胞形态发生以及细胞连接和突触组织。在脑干中，少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞在两组间也呈现差异表达谱。
在神经内分泌层面，研究对垂体和肾上腺进行单核测序，并结合外周免疫与应激指标分析。结果显示，母体菌群移植与 HPA 轴细胞间通讯的协同重塑、应激反应转录程序及免疫特征改变相关，同时循环皮质醇（cortisol）水平降低。这意味着母体微生物信号不仅改变脑内细胞状态，也通过肠-脑-神经内分泌轴调节机体应激设定点。
FIGURE 3 FIGURE 3: 猪脑主要胶质细胞群中的转录调控程序和候选调控子。(A) 332,425个胶质细胞核的UMAP可视化，包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞。标注了细胞数量。(B) 基于CSI的SCENIC调控子分析显示六个共调控模块（M1–M6）。每个模块显示代表性转录因子及相应结合基序。颜色强度表示CSI值。(C) 使用基于Jensen–Shannon散度的调控子特异性评分（JSD-RSS）鉴定的细胞类型特异性调控子。点的颜色表示JSD-RSS，点的大小表示每个调控子的贡献。(D) MMTD30与GFD30仔猪间BS中少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞的差异基因表达谱。显示代表性基因和选定的富集GO条目。(E) 星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞中细胞类型DEGs与SCENIC衍生调控子转录因子之间的重叠。(F) 星形胶质细胞中以FOXO1和TEAD1为中心的调控子网络及其预测靶基因。(G) MMTD30星形胶质细胞中预测响应计算机模拟TEAD1敲除的基因调控网络。(H) 预测响应TEAD1敲除基因的GO富集。点的大小表示基因计数，颜色表示−log10（校正p值）。CSI，连接特异性指数；DEG，差异表达基因；GFD30，出生后第30天的无菌仔猪；JSD，Jensen–Shannon散度；MMTD30，出生后第30天的母体微生物群移植仔猪；TF，转录因子；RSS，调控子特异性评分。所有snRNA-seq分析均基于每个实验组三头独立仔猪（n = 3）；单个细胞核未视为独立生物学重复。
FIGURE 4 FIGURE 4: 母体微生物群移植与HPA轴通讯、应激相关转录重塑及外周免疫改变相关。(A) 来自HYP、PIT和ADR的细胞核UMAP可视化，按注释细胞类型着色。(B) GFD30和MMTD30仔猪中主要HYP细胞群间CellChat推断的细胞间通讯网络。边宽表示推断的相互作用数量。(C) 主要HYP细胞群间的累积评分相互作用网络。上方和下方网络分别代表GFD30和MMTD30仔猪。边宽表示累积相互作用评分。(D) 显示GFD30（上）和MMTD30（下）仔猪HYP细胞群中选定配体–受体基因对表达模式的点图。点的大小表示表达相应基因的细胞比例，颜色表示组内平均表达量。(E) 在GFD30与GFD0比较（上）和MMTD30与GFD30比较（下）下，HYP、PIT和ADR之间共享及组织特异性DEGs的维恩图。(F) GFD30与GFD0比较中HYP、PIT和ADR共享的1655个DEGs（上）和MMTD30与GFD30比较中822个共享DEGs（下）的GO富集。显示校正p值。(G) GFD30和MMTD30中HYP、PIT和ADR代表性应激相关基因热图。颜色表示行标准化Z分数。(H) GFD30和MMTD30仔猪血浆皮质醇浓度。数据以平均值 ± 标准差表示。*p < 0.05。(I) GFD30和MMTD30仔猪血清IL-6、IL-1ra、IL-10、TNF-α浓度。单个点代表独立生物学重复。数据以平均值 ± 标准差表示。*p < 0.05。ADR，肾上腺；DEG，差异表达基因；GO，基因本体；GFD0，出生后第0天的无菌仔猪；GFD30，出生后第30天的无菌仔猪；HPA，下丘脑–垂体–肾上腺；HYP，下丘脑；MMTD30，出生后第30天的母体微生物群移植仔猪；OPCs，少突胶质前体细胞；PIT，垂体。所有组水平分析均基于每组三头独立仔猪（n = 3）。
核心发现四：肠道分段重塑与跨物种遗传关联
在肠道方面，整合分析揭示了分段特异的转录和代谢重塑，包括色氨酸/吲哚相关代谢物及免疫相关通路的变化。这些肠道来源的代谢信号可能通过循环系统影响脑与HPA轴。
更具转化意义的是，研究者通过跨物种分层连锁不平衡评分回归（S-LDSC）分析发现：来源于“母体菌群响应性猪细胞群”的细胞类型特异基因特征中，富集了人类认知与神经精神性状相关的遗传信号。也就是说，猪模型中由菌群调控的细胞程序，与人类复杂脑性状（包括认知、神经精神疾病风险）的遗传架构存在交集。
FIGURE 5 FIGURE 5: 沿肠–脑轴的母体微生物群相关肠道转录和代谢重塑。(A) 肠–脑相互作用示意图。(B) 显示肠道样本中WGCNA模块特征基因表达的热图。样本注释表示实验组和肠段。(C) WGCNA模块与微生物状态或发育阶段之间的模块–性状关系。颜色表示相关系数。(D) 在MMTD30与GFD30和GFD30与GFD0比较下，十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠中上调和下调DEGs的数量。(E) MMTD30与GFD30中五个肠段DEGs的GO富集。每个肠段显示按GeneRatio排前五的条目；点的大小表示基因计数，颜色表示GeneRatio。(F) MMTD30与GFD30比较下空肠中DEGs的火山图。红色和蓝色分别表示上调和下调基因。(G) 五集合维恩图显示MMTD30与GFD30中所有五个肠段一致上调的50个基因。(H) LYZ表达水平以TPM表示（平均值 ± 标准误）。统计学显著性由DESeq2基于原始读数确定，P值经Benjamini–Hochberg方法校正。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001（ns，不显著）。(I) GFD30和MMTD30仔猪空肠、回肠和结肠中代表性差异代谢物的相对丰度。代谢物丰度以log10转换的峰面积表示。单个点代表生物学重复。*p < 0.05和***p < 0.001。(J) MMTD30与GFD30间差异血浆代谢物的KEGG通路富集。柱长表示分配到每个通路的差异代谢物数量。(K) MMTD30与GFD30中前五增加和前五减少的血浆代谢物。正log2FC值表示在MMTD30中丰度较高，负值表示在GFD30中丰度较高。肠道转录组和代谢组分析基于每个实验组三头独立仔猪（n = 3）。
FIGURE 6 FIGURE 6: 跨猪脑和HPA轴的人类复杂性状相关信号的跨物种遗传富集与空间分布。(A) 环形热图显示来自AMY、HIP、HYP、BS、mPFC、PIT和ADR的组织分辨细胞群中人类GWAS衍生遗传信号的S-LDSC富集。分析性状包括双相II型障碍、心境障碍、自闭症谱系障碍、精神分裂症、轻度认知障碍、抑郁、智力、睡眠时长、杏仁核体积和阿尔茨海默病。颜色表示每SNP富集估计，外环注释表示每个细胞群的组织来源。星号表示经Benjamini–Hochberg校正后显著富集（FDR < 0.05）。(B) GFD30和MMTD30空间转录组切片中教育程度（EA2）和智商（IQ）相关信号的空间可视化。红色虚线轮廓突出相应空间区域。EA2，教育程度；FDR，错误发现率；GFD30，出生后第30天的无菌仔猪；GWAS，全基因组关联研究；IQ，智商；MMTD30，出生后第30天的母体微生物群移植仔猪；S-LDSC，分层连锁不平衡评分回归。用于S-LDSC的猪细胞类型转录注释来源于三头独立MMTD30和三头独立GFD30仔猪（每组n = 3）。
方法亮点：大型动物多组学图谱的技术整合
该研究的创新在于把多个前沿技术叠加在一个大型动物模型上：
- 无菌与菌群移植模型：利用GF和MMT仔猪控制微生物暴露变量；
- 多区域单核RNA测序：跨越五个脑区及垂体、肾上腺，获得67万余个核；
- 空间转录组（Stereo-seq）：在下丘脑定位细胞群的空间架构；
- 肠道bulk RNA-seq与代谢组：解析分段转录和色氨酸/吲哚代谢；
- 跨物种S-LDSC：将猪细胞特征映射到人类GWAS信号。
这种“从微生物操作到多器官单细胞分辨率，再到人类遗传富集”的框架，为在生理结构更接近人类的物种中研究环境-基因-脑发育交互提供了模板。
应用意义：从发育编程到转化医学
这项研究确立了首个连接母体菌群响应性脑、肠和神经内分泌轴重塑的大型动物细胞图谱。其意义至少包括三方面：
第一，在基础科学层面，它证明母体菌群不是“背景噪声”，而是主动参与新生儿神经元成熟、胶质细胞调控、神经元-胶质通讯以及HPA轴应激编程的环境信号；
第二，在模型层面，猪被证明是优于啮齿类的转化平台，可用于解析菌群依赖的发育编程；
第三，在临床前层面，研究提示早期生命微生物暴露可能通过谷氨酸代谢、NRG-ERBB4信号和皮质醇调节，影响远期认知与神经精神疾病风险，为未来以微生物为靶点的早期干预提供理论依据。
小结：从无菌仔猪到菌群移植，从五个脑区到HPA轴与肠道分段，这项 iMeta 研究用67万个细胞核和空间图谱告诉我们：母亲体内的微生物，正在以细胞级精度书写后代大脑与应激系统的发育程序。
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