空间转录组绘制先天性巨结肠肠微环境图谱：THBS1调控巨噬细胞与神经互作

原文：Mapping intestinal microenvironment heterogeneity in Hirschsprung's disease by spatial transcriptomics: Role of THBS1 in macrophage polarization and neural stem cell regulation.
期刊：Genes & diseases（影响因子 14.6） |  PubMed | PMC 全文（含 PDF）

先天性巨结肠（Hirschsprung's disease, HSCR）是新生儿常见的消化道先天性畸形，其核心病理特征是结肠远端某一段肠壁内完全或部分缺失神经节细胞。由于病变肠段持续痉挛收缩、近端结肠代偿性扩张，患儿在出生后即面临严重的排便障碍。目前，外科手术切除无神经节细胞的肠段仍是主要治疗手段，但部分患儿术后仍会出现大便失禁、便秘等并发症，生活质量受到长期影响。因此，深入揭示 HSCR 的发病机制、寻找新的干预靶点，是儿科外科与发育生物学领域亟待突破的问题。

传统观点认为，HSCR 主要源于肠神经嵴细胞（enteric neural crest cells）在迁移、存活和分化过程中的异常。已知 Ret、Gdnf、Gfra1、Nrtn、Ednrb、Et3、Zfhx1b、Phox2b、Sox10 等基因突变可解释约一半的病例。然而，遗传因素并不能完全说明疾病全貌。近年来，“肠微环境理论”逐渐受到重视：细胞外基质（ECM）和可溶性因子构成的局部微环境，对肠神经嵴细胞的发育具有关键调控作用；微环境异常本身也可能参与致病。问题在于，过去的研究多依赖单细胞 RNA 测序，而组织被解离成单细胞悬液后，天然的空间位置信息丢失，我们很难看清“在肠壁的哪个区域、哪类细胞旁边、哪些分子在起作用”。

核心发现：首张 HSCR 空间转录组图谱揭示 THBS1 下调

为解决这一瓶颈，重庆医科大学附属儿童医院团队联合相关研究者，利用 10× Genomics Visium 空间转录组技术，对 3 例 HSCR 患儿手术切除标本和 1 例年龄匹配的非 HSCR 肠梗阻对照患儿组织进行了测序。每位 HSCR 患者提供了痉挛段（spastic）、移行段（transitional）、扩张段（dilated）和近端段（proximal）等多个区域样本，最终共处理 8 个组织节段（7 个来自 HSCR 患者、1 个为对照正常区域），构建了首个 HSCR comprehensive 空间转录组图谱。

通过 Space Ranger 进行数据质控、Seurat 进行归一化与降维聚类，研究者获得了 18 个空间斑点簇（clusters），并结合 UMAP 可视化展示了各簇在组织中的空间位置与转录组相似性。进一步利用 RCTD 去卷积方法，以包含间充质、上皮、内皮、髓系、神经元、T 细胞、B 细胞和红细胞等 8 类主要肠细胞类型的单细胞参考数据集，估算每个 55 μm 斑点内的细胞组成，从而把“空间位置—细胞类型—基因表达”三者联系起来。

差异表达分析显示，在 HSCR 无神经节细胞（aganglionic）肠段中，THBS1（thrombospondin 1，血小板反应蛋白 1）是一个持续下调的基因。THBS1 属于 ECM 相关分子，既往研究提示其参与细胞黏附、迁移和组织重塑。空间表达模式图进一步表明，THBS1 的缺失区域与 M2 型巨噬细胞富集特征密切相关。

图 2 展示了调控肠神经嵴细胞的 ECM 与免疫细胞相关基因在各簇中的表达情况，以及差异表达基因的火山图。研究者通过 GO、KEGG 富集分析和 STRING 蛋白互作网络，将差异基因定位到 ECM 组织、免疫微环境调控等通路上，说明 HSCR 肠壁并非只是“神经细胞少了”，而是整个局部微环境发生了空间异质性重塑。

借助 CellChat 对空间斑点进行细胞间通讯推断（每个斑点被视为混合“元细胞”，并排除低评分混合斑点以降低噪音），团队发现 THBS1–SDC1（syndecan 1）配体–受体对是巨噬细胞与神经相关细胞之间潜在的重要信号轴。图 3 通过 UMAP 展示各类细胞富集分数，并呈现 THBS1 在 HSCR 肠微环境中的空间表达及 M2 巨噬细胞富集格局。

实验验证：THBS1 促进 M2 极化并增强神经细胞增殖迁移

为验证空间组学提出的假设，研究者开展了体外实验。他们以人急性单核细胞白血病细胞系 THP-1（经 PMA 诱导为巨噬细胞模型）和人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y（源自神经嵴、保留神经元特征，用作神经细胞模型）为系统。需要说明，SH-SY5Y 并非原代肠神经嵴细胞或神经干细胞，作者也明确指出其不能完全模拟原代肠神经元生物学，但可作为机制探索的替代模型。

在临床样本层面，qPCR 与 Western blot 验证了 HSCR 组织中 THBS1 表达降低，同时 M2 型巨噬细胞标志物 CD206、ARG1 等表达改变，免疫组化进一步在组织切片上确认了 THBS1 与 M2 巨噬细胞的空间关系。

在 THP-1 细胞中敲低 THBS1（使用两条独立 siRNA）或过表达 THBS1（pcDNA3.1-THBS1 质粒）后，流式细胞术、免疫荧光和 Western blot 结果显示：THBS1 可促进巨噬细胞向 M2 样表型极化（CD206、ARG1 上升，CD86 等 M1 标志下降），并且 THBS1 与 SDC1 存在相互作用（Co-IP 验证）。

更关键的是，在非接触式 Transwell 共培养体系中，将过表达 THBS1 的巨噬细胞置于上室、SH-SY5Y 细胞置于下室，仅允许可溶性因子交换而不直接接触。24 小时后收集 SH-SY5Y 细胞进行功能检测：CCK8 实验显示细胞活力增强，克隆形成实验表明增殖能力提高，划痕实验和 Transwell 迁移实验显示迁移能力增强，而 Annexin V/PI 凋亡检测提示凋亡减少。也就是说，巨噬细胞来源的 THBS1 通过塑造微环境，间接促进了神经样细胞的存活、扩增和迁移。

方法亮点：空间转录组弥补单细胞测序的“位置盲区”

本研究的技術創新在於把空間轉錄組（ST）引入 HSCR 研究。與單細胞 RNA 測序相比，ST 不需要把組織打散，而是把新鮮組織包埋、冰凍切片後，在帶有條形碼探針的玻片上原位捕獲 mRNA，再進行 cDNA 合成與測序。這樣每個 55 μm 斑點都保留了“在組織的哪一層、哪一段”的信息。

分析流程上，研究者用 SCTransform 歸一化、PCA 降維、UMAP 可視化，並以分辨率 0.4 進行無監督聚類；用 AddModuleScore 和 RCTD 雙策略註釋細胞類型；用 CellChat 在斑點水平推斷配體–受體通訊，並通過敏感性分析排除高異質性斑點（entropy > 0.8）後，THBS1–SDC1 等主要互作對依然穩健。這種“空間位置+細胞組成+通訊網絡”的三層分析框架，為複雜組織微環境研究提供了可復用的範式。

應用意義：從微環境角度理解 HSCR，為新療法鋪路

該研究首次在空間尺度上描繪了 HSCR 腸道微環境的異質性，並把 THBS1 推到舞台中央：它在病變腸段中下調，可能通過影響巨噬細胞極化（向 M2 樣）及與 SDC1 的互作，調節神經細胞的增殖、遷移和凋亡。這意味著 HSCR 不只是“神經嵴細胞自己沒走好”，局部 ECM 和免疫細胞構成的微環境同樣是疾病進展的重要參與者。

從臨床角度看，若未來能在原代細胞和更大隊列中驗證 THBS1 通路，它可能成為評估病變範圍、預測術後並發症的潛在生物標誌物；而調控巨噬細胞極化或補充 THBS1 信號，也有望發展為保護殘餘神經功能、改善腸動力的新策略。當然，作者也審慎指出，當前體外實驗基於 THP-1 與 SH-SY5Y 細胞系，仍需原代細胞和體內模型進一步確認。

總之，這項發表於 Genes & Diseases（影響因子 14.6）的工作，以空間轉錄組為顯微鏡，讓我們第一次“看見”了 HSCR 腸壁中基因表達的空間版圖，並為理解巨噬細胞–神經互作提供了新線索。

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