原文：Metabolic reprogramming of NK cells in chronic brucellar arthritis: role of the HIF-1α/mTOR axis. PubMed | PMC 全文（含 PDF）
研究背景：一种被忽视却致残率高的传染病并发症
布鲁氏菌病（brucellosis）是由布鲁氏菌（Brucella ）引起的一种全球性人畜共患传染病。根据论文正文引用的数据，全球每年新发人类病例超过 50 万例。它不仅威胁公共健康，也给畜牧业造成巨大经济损失。在布鲁氏菌病的众多临床表现中，骨关节受累是最常见的并发症，约 40%–85% 的患者会出现关节炎、骶髂关节炎或脊柱炎。
在急性期（病程 <3 个月），布鲁氏菌关节炎通常表现为大关节（如膝、髋、骶髂关节）的游走性剧痛，与菌血症和急性滑膜炎直接相关。而当疾病进入慢性期（>6 个月），核心病理特征转变为骨破坏、关节侵蚀和免疫逃逸，最终可导致关节功能障碍甚至残疾。尽管联合抗生素治疗能有效控制急性期感染，仍有约 10%–30% 的患者会发展为慢性关节炎。其关键原因在于：科学界对布鲁氏菌感染触发的持续性关节免疫病理损伤机制了解不足。
自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统的核心成员，也是抗感染的第一道防线。无需预先致敏，NK 细胞就能通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤感染细胞，并分泌 IFN-γ 等细胞因子激活巨噬细胞和适应性免疫。在急性布鲁氏菌感染中，NK 细胞被迅速动员至感染部位，通过产生 IFN-γ 激活巨噬细胞杀菌活性，对控制早期菌血症至关重要。然而，临床证据显示，慢性布鲁氏菌病患者外周血 NK 细胞数量减少且功能受损，IFN-γ 和颗粒酶 B 分泌下降，提示布鲁氏菌可能利用免疫逃逸机制削弱了 NK 细胞的保护作用。但直到这项研究之前，调控布鲁氏菌关节炎中 NK 细胞功能状态的关键分子机制仍未明确。
近年来，免疫细胞的“代谢重编程”被认为是决定其功能命运的核心事件。静息 NK 细胞主要依赖线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）维持能量；激活后则迅速转向糖酵解（Warburg 效应），以满足快速增殖和效应功能所需的 ATP 与生物合成前体。这种灵活的代谢切换是 NK 细胞正常抗感染功能的前提。缺氧诱导因子 HIF-1α 是调控代谢切换的关键转录因子；而 mTOR 则是整合能量代谢、营养感知和免疫信号的中心枢纽。在肿瘤微环境中，持续 HIF-1α 信号可通过多种机制抑制 mTOR 活性，限制 NK 细胞代谢。但在布鲁氏菌关节炎中，HIF-1α 是否通过抑制 mTOR 诱导 NK 细胞代谢重编程、从而推动疾病慢性化，此前从未被探索。
核心发现：HIF-1α 过表达压制 mTOR，让 NK 细胞“代谢瘫痪”
这项发表于 Frontiers in Immunology （影响因子 7.0）的研究，题为“Metabolic reprogramming of NK cells in chronic brucellar arthritis: role of the HIF-1α/mTOR axis”，由石河子大学第一附属医院等团队完成。研究者收集了健康对照、急性期布鲁氏菌关节炎患者（A-BA，n=20）和慢性期患者（C-BA，n=20）的外周血与滑膜组织样本，系统解析了 NK 细胞在疾病中的表型、功能、代谢特征和 HIF-1α/mTOR 通路活性。
首先，单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）显示，布鲁氏菌关节炎患者的滑膜中富集了 NK 细胞，并且这些细胞的氧化磷酸化（OXPHOS）相关基因表达异常。
Figure 1 布鲁氏菌性关节炎患者滑膜中NK细胞的富集与代谢异常。(A) 实验流程：从滑膜组织活检、组织解离、GEM形成与条形码标记，到单细胞数据分析与细胞聚类。(B, C) t-SNE降维图显示健康对照（Healthy, (C), n=2,883个细胞）和慢性布鲁氏菌性关节炎患者（Bru, C, n=5,419个细胞）滑膜免疫细胞的分布。基于经典标志物表达注释细胞亚群，并列出细胞数量：NK_CD56dim (293)、NK_CD56bri (20)、NKT (1,210)、CD4+调节性T细胞（Treg, 3,095）、CD8+ Temra (1,467)、CD8+ Trm (623)、CD8+ Tem (1,291)和CD8+增殖T细胞（Proliferating, 303）。(D) 健康对照与布鲁氏菌性关节炎患者滑膜中NK细胞的比例。(E) 各细胞亚群关键信号通路活性评分热图。与T细胞亚群相比，NK细胞亚群表现出mTOR信号通路和氧化磷酸化（OXPHOS）相关通路的显著高活性。(F, G) 各细胞亚群间mTOR通路活性评分的定量比较。(H) HIF-1α表达水平在各细胞亚群中的分布。(I) 小提琴图显示健康对照（NC, n=3）和慢性布鲁氏菌病关节炎患者（Bru, n=4）滑膜NK细胞中HIF-1A和糖酵解相关基因（SLC2A1、LDHA、PDK1、HK2、PFKP、PKM）的表达水平。数据基于10x Genomics单细胞转录组测序（每个样本捕获约10000个细胞），健康对照（n=3）和慢性期患者（n=4）的独立生物学重复。使用UMAP/t-SNE进行降维，通过基因集富集分析（GSEA）计算通路活性。所有数据在可视化前均已标准化。临床样本分析进一步表明：与健康对照相比，急性期和慢性期患者外周血中 NK 细胞比例都升高了；但关键在于，慢性期患者的 NK 细胞虽然“数量不少”，功能却显著衰退——IFN-γ、颗粒酶 B 和 CD107a 脱颗粒水平都明显下降。也就是说，慢性期的 NK 细胞处于一种“功能耗竭”状态。
Figure 2 布鲁氏菌性关节炎中外周血NK细胞功能抑制与HIF-1α/mTOR通路抑制相关。(A, B) 各组（健康对照，HC；急性期，A-BA；慢性期，C-BA）外周血CD3-CD56+ NK细胞比例的流式细胞术分析。与HC相比，急性和慢性期患者NK细胞比例均升高。流式细胞术还检测了各组NK细胞的IFN-γ产生和脱颗粒功能（CD107a阳性）。慢性期患者NK细胞的IFN-γ和CD107a表达水平显著低于急性期患者。(C) 各组滑膜组织中HIF-1α和颗粒酶B的表达水平。慢性期患者HIF-1α升高、颗粒酶(B)降低。(D) 各组患者HIF-1α蛋白表达的Western blot分析。慢性期患者HIF-1α蛋白条带明显增强。(E, F) 各组NK细胞中PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化水平（p-PI3K、p-AKT、p-mTOR）和总mTOR的Western blot检测。与HC相比，慢性期患者p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平显著降低。(G) 各组NK细胞中颗粒酶B、IFN-γ和HIF-1α的相对mRNA表达水平（qPCR结果）。数据以均值±标准差表示（Western blot/qPCR每组n=3，流式细胞术每组n=20，或至少3次独立实验）。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001；ns，无显著性。统计方法：单因素方差分析结合Tukey事后检验（经Shapiro-Wilk正态性检验后）或酌情使用Student t检验；多重比较采用Benjamini-Hochberg法校正P值。在血清细胞因子层面，研究检测了 IFN-γ、TNF-α、颗粒酶 B、IL-10、IL-13 和 IL-18 的浓度变化，勾勒出不同疾病阶段的免疫因子图谱。
Figure 3 健康对照和不同疾病期布鲁氏菌性关节炎患者的血清细胞因子谱。(A, B) 健康对照（HC）、急性期（A-BA）和慢性期（C-BA）患者血清中IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B、IL-10、IL-13和IL-18的浓度（pg/mL）。数据以均值或范围表示（每组n=20）。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001；ns，无显著性。统计方法：单因素方差分析结合Tukey事后检验（经正态性检验后）或酌情使用Kruskal-Wallis检验；多重比较采用Benjamini-Hochberg法校正P值。机制上，研究者发现：患者 NK 细胞中 HIF-1α 蛋白持续过表达，而 mTOR 通路的关键磷酸化蛋白（p-PI3K、p-AKT、p-mTOR）却被显著抑制。为了排除活菌感染带来的混杂因素，团队在体外使用热灭活的布鲁氏菌 16M（HKBA）刺激 NK-92 细胞。结果显示，HKBA 以剂量和时间依赖方式抑制 NK-92 细胞中的 mTOR 通路活性，并通过 JC-1 染色显示线粒体膜电位下降。
Figure 4 热灭活布鲁氏菌16M（HKBA）对NK-92细胞活力、HIF-1α表达和mTOR通路磷酸化的剂量和时间依赖性效应。(A) HKBA对NK-92细胞活力的MOI和时间依赖性效应。用不同感染复数（MOI：0、1、10、50、100、200、500）的HKBA处理NK-92细胞24、48或72小时，通过CCK-8法评估细胞活力。(B) HKBA对NK-92细胞中HIF-1α蛋白表达的MOI依赖性效应。(C) HIF-1α蛋白表达的定量分析。(D) HKBA对NK-92细胞中mTOR信号通路蛋白磷酸化的影响。(E) mTOR通路磷酸化蛋白的定量分析。数据以倍数变化、均值±标准差表示（n=3）。采用独立样本t检验进行统计分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001；ns，无显著性。为了确认因果，研究者利用 CRISPR/Cas9 构建了 HIF-1α 敲除（KO）的 NK-92 细胞系。
Figure 5 利用CRISPR/Cas9生成HIF-1α敲除的NK-92细胞。(A) RNP介导的大片段基因缺失实验流程（实验流程：RNP介导的大片段缺失策略）。步骤1：Cas9与向导RNA组装。步骤2：电转NK-92细胞。步骤3：单细胞分离与克隆建立。步骤4：PCR基因分型。(B) 人HIF1A基因18.5 kb缺失的分子策略（18.5 kb人HIF1A基因缺失的分子策略）。gRNA-A1靶向外显子2下游，gRNA-A2靶向外显子10上游。两种RNP复合物分别在基因组DNA中诱导双链断裂（DSB）；直接连接并纯合缺失中间18.5 kb序列产生敲除克隆1D9，其在基因组水平破坏HIF1A完整编码序列。(C) 缺氧条件下HIF-1α敲除的细胞表型（缺氧条件下HIF1A敲除的细胞表型）。左：野生型（WT）细胞——在布鲁氏菌病微环境缺氧（低氧张力）下，HIF-1α蛋白在胞质稳定积累，转位入核，结合靶基因启动子，启动下游缺氧反应靶基因转录。右：1D9敲除克隆——HIF1A基因被敲除（红叉表示基因失活），无功能性HIF-1α蛋白合成，无HIF-1α核转位，下游缺氧靶基因无法转录，导致缺氧诱导的HIF-1通路激活丧失。结果非常明确：HIF-1α 敲除后，NK 细胞的细胞毒功能显著恢复，IFN-γ 和 CD107a 水平回升，OXPHOS 和糖酵解相关基因表达上调，线粒体膜电位也得到改善。
Figure 6 HIF-1α敲除恢复NK细胞效应功能并抵消HKBA诱导的抑制。(A) 各组NK细胞中IFN-γ阳性细胞百分比的流式细胞术分析。NK-92细胞或HIF-1α敲除（KO）NK-92细胞与K562靶细胞共培养，或经HKBA处理（MOI = 100）后培养，检测胞内IFN-γ和CD107a表达。(B) 各组NK细胞脱颗粒功能（CD107a阳性率）检测结果。数据以均值±标准差表示（n=3次独立实验）。采用双因素方差分析或t检验进行统计分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001；ns，无显著性。转录组测序进一步证实，敲除 HIF-1α 后，mTOR 信号和能量代谢相关基因集显著富集。
Figure 7 HKBA处理后WT和HIF-1α-KO NK-92细胞的转录组分析。(A) 火山图显示HKBA（MOI = 100）处理72 (h)后野生型（WT）和HIF-1α敲除（KO）NK-92细胞间的差异表达基因。(B) 热图显示WT和KO样本在转录组水平的聚类。(C) KEGG通路富集分析结果，显示KO组上调基因显著富集于多条能量代谢和信号通路。数据基于三次独立生物学重复。在代谢层面，Seahorse 分析显示，HIF-1α 敲除恢复了 NK-92 细胞在 HKBA 处理后的 mTOR 通路活性、线粒体呼吸、糖酵解能力以及效应分子表达。
Figure 8 HIF-1α敲除恢复HKBA处理后NK-92细胞中mTOR通路活性、线粒体呼吸、糖酵解和效应分子表达。野生型（WT）NK-92细胞和HIF-1α敲除（KO）NK-92细胞用HKBA（MOI = 100）处理72小时，或不处理作为对照。(A) 各组PI3K/AKT/mTOR信号通路及下游效应分子磷酸化水平的Western blot分析。(B) 磷酸化蛋白与总蛋白比值的定量分析（倍数变化）。(C) 通过Seahorse XFe96代谢分析仪测量的耗氧率（OCR），反映线粒体氧化磷酸化功能。依次注射寡霉素（1 μmol/L）、FCCP（1 μmol/L）和鱼藤酮/抗霉素A（ROT/AA, 0.5 μmol/L）后实时测量OCR。(D) 基于(C)的OCR参数定量分析。数据以OCR（pmol/min）、均值±标准差表示（n=3）。(E) 通过Seahorse XFe96测量的细胞外酸化率（ECAR），反映糖酵解活性。依次注射葡萄糖（10 mmol/L）、寡霉素（1 μmol/L）和2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG, 50 mmol/L）后实时测量ECAR。(F) 基于(E)的ECAR参数定量分析。数据以ECAR（mpH/min）、均值±标准差表示（n=3）。(G) 通过PCR检测IFN-γ和颗粒酶B分泌能力。(H) 各组NK细胞代表性JC-1荧光图像，显示JC-1红色聚集体通道、绿色单体通道和合并荧光图像。(I) JC-1红/绿荧光比值的定量分析，反映各组线粒体膜电位水平。数据以均值±标准差表示，重复三次独立实验。所有比较采用单因素方差分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001；ns，无显著性（P > 0.05）。最关键的一步是：当研究者使用 mTOR 抑制剂雷帕霉素（rapamycin）处理时，HIF-1α 敲除所带来的 NK 细胞功能和线粒体适应性恢复被完全阻断。这证明——HIF-1α 主要是通过抑制 mTOR 信号，来驱动 NK 细胞的代谢与功能异常。
Figure 9 mTOR抑制剂雷帕霉素完全阻断HIF-1α敲除对NK细胞代谢和功能的恢复作用。野生型（WT）NK-92细胞和HIF-1α敲除（KO）NK-92细胞用HKBA（MOI = 100）处理72小时，或不处理作为对照。部分实验组在加入HKBA前用mTOR通路抑制剂雷帕霉素（100 nM）预处理1小时。(A) 各组PI3K/AKT/mTOR信号通路及下游效应分子磷酸化水平的Western blot分析。(B) 磷酸化蛋白与总蛋白比值的定量分析（倍数变化）。(C) 通过Seahorse XFe96代谢分析仪测量的耗氧率（OCR），反映线粒体氧化磷酸化功能。依次注射寡霉素（1 μmol/L）、FCCP（1 μmol/L）和鱼藤酮/抗霉素A（ROT/AA, 0.5 μmol/L）后实时测量OCR。(D) 基于(C)的OCR参数定量分析。数据以OCR（pmol/min）、均值±标准差表示（n=3）。(E) 通过Seahorse XFe96测量的细胞外酸化率（ECAR），反映糖酵解活性。依次注射葡萄糖（10 mmol/L）、寡霉素（1 μmol/L）和2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG, 50 mmol/L）后实时测量ECAR。(F) 基于(E)的ECAR参数定量分析。数据以ECAR（mpH/min）、均值±标准差表示（n=3）。(G) 通过PCR检测IFN-γ和颗粒酶B分泌能力。(H) 各组NK细胞代表性JC-1荧光图像，显示JC-1红色聚集体通道、绿色单体通道和合并荧光图像。(I) JC-1红/绿荧光比值的定量分析，反映各组线粒体膜电位水平。数据以均值±标准差表示，重复三次独立实验。所有比较采用单因素方差分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001；ns，无显著性（P > 0.05）。综合所有结果，研究团队提出了如下机制模型：布鲁氏菌感染诱导 NK 细胞中 HIF-1α 过表达，HIF-1α 抑制 mTOR 信号，迫使 NK 细胞能量代谢从高效的线粒体 OXPHOS 转向低效且僵化的糖酵解依赖状态，导致线粒体呼吸储备下降、ATP 产生不足、效应分子合成受损，最终使 NK 细胞走向功能抑制，加剧布鲁氏菌免疫逃逸和慢性关节炎症。
Figure 10 布鲁氏菌通过HKBA–HIF-1α–mTOR轴诱导NK细胞代谢重编程和功能抑制的机制示意图。方法亮点：从临床样本到基因编辑的多维度证据链
这项研究的方法设计有几个值得称道的细节。首先，它同时使用了临床样本（外周血、滑膜组织）与体外细胞模型（NK-92 细胞系），并结合 scRNA-seq、流式细胞术、qPCR、JC-1 线粒体膜电位检测、Seahorse 代谢分析和 Western blotting，形成了从表型到机制、从基因到蛋白、从整体到代谢通量的完整证据链。
其次，研究者特意选择热灭活布鲁氏菌（HKBA）而非活菌进行体外刺激。他们在正文中详细解释了这一选择的合理性：热灭活菌不会消耗培养基营养，避免活菌与宿主竞争葡萄糖和氨基酸造成的“假饥饿”状态，从而真实测量营养敏感通路 HIF-1α/mTOR；同时避免活菌通过 T4SS 分泌效应蛋白（如 BtpB）主动消耗 NAD+/NADH/ATP 来重编程宿主代谢；并且 HKBA 保留了脂蛋白、LPS 等完整 PAMPs，足以通过 TLR 触发初始代谢重编程。作者也坦承其局限，强调未来需在活菌感染背景下验证结论。
第三，研究通过 CRISPR/Cas9 RNP 电转实现了 HIF1A 大片段（18.5 kb 编码区）敲除，并用地高辛/嘌呤霉素筛选和基因组 PCR 测序确认移码突变，保证了基因编辑模型的可靠性。再结合雷帕霉素反向干预，形成了“敲除恢复—抑制剂阻断”的闭环因果验证。
此外，在生物安全方面，涉及活布鲁氏菌的操作均在新疆疾控中心 BSL-3 实验室、依据国家标准（CNAS-CL05:2009、GB 19489:2008）完成；而所有体外功能实验实际仅使用 HKBA，并未进行活菌感染细胞，但仍按上述标准操作以确保安全。滑膜组织方面，健康对照来自关节镜手术患者，慢性期患者获取标本，而急性期因处于活动性菌血症状态、活检有出血和感染扩散风险，故未获取急性期滑膜标本——这一伦理与安全考量也在文中明确说明。
应用意义：为慢性布鲁氏菌关节炎提供代谢免疫治疗新思路
这项研究的价值不仅在于解释了一个长期未明的免疫病理机制，更在于指出了潜在的治疗靶点。当前，抗生素虽能控制急性期布鲁氏菌感染，但对已经形成的慢性关节炎效果有限。约 10%–30% 的患者会走向慢性化、甚至残疾，临床亟需针对“持续性关节免疫损伤”的干预策略。
本研究提示：靶向 HIF-1α/mTOR 轴，可能成为逆转 NK 细胞抑制、阻断布鲁氏菌关节炎慢性化的新策略。如果能在体内恢复 NK 细胞的 mTOR 活性与线粒体代谢适应性，就有望重建其抗感染效应功能，减少布鲁氏菌在关节局部的免疫逃逸。
从更广的视角看，这项工作把“免疫代谢重编程”这一前沿概念引入布鲁氏菌病研究，连接了感染、关节病理与细胞代谢三个领域。它说明：慢性感染中的免疫细胞耗竭，不只是“信号分子减少”那么简单，而是深层的能量代谢被病原体相关信号重新布线。对于从事感染免疫、风湿病学和免疫代谢研究的科研人员而言，这一 HIF-1α/mTOR 轴既是机制线索，也是可转化的干预窗口。
当然，作者也谨慎指出，HKBA 模型不能完全模拟活菌完整感染过程，未来仍需在活菌感染及动物模型中进一步验证。但无论如何，这项研究已经为理解慢性布鲁氏菌关节炎的免疫代谢机制点亮了一盏灯。
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